海南粗榧。受访者供图三尖杉酯类生物碱具有广谱抗癌作用，在临床上主要用于急性白血病的治疗。然而，能天然产生这类生物碱的植物几乎都已濒临灭绝。科学家试图找到人工合成三
海南粗榧。受访者供图
三尖杉酯类生物碱具有广谱抗癌作用，在临床上主要用于急性白血病的治疗。然而，能天然产生这类生物碱的植物几乎都已濒临灭绝。科学家试图找到人工合成三尖杉酯类生物碱的方法。
2022年12月29日，《美国国家科学院院刊》（PNAS） 在线发表中国热带农业科学院（以下简称热科院）热带作物品种资源研究所研究员乔飞团队最新成果。该团队首次解析了海南粗榧三尖杉酯类生物碱的碳骨架分子的生物合成通路，并明确了多巴胺和4-羟基苯丙醛（4-HDCA）的生物合成途径。这一研究结果将为这一广谱抗癌药物的生物合成奠定基础。
濒临灭绝的“抗癌奇木”
论文共同第一作者乔飞告诉《中国科学报》，作为抗癌药物，三尖杉酯类生物碱中的高三尖杉酯碱和三尖杉酯碱已经纳入我国药典，美国FDA也批准高三尖杉酯碱临床使用。
不过当前，三尖杉酯类生物碱主要提取自三尖杉科植物。该科植物主要有三尖杉和粗榧，均生长极其缓慢，生境狭窄，多处于濒危的边缘。
并且，这类植物中的三尖杉酯类生物碱含量极低，从植物中大量提取非常困难。化学合成也未能解决其商业化生产的难题，导致该药品价格昂贵，成为其临床上广泛使用的主要障碍。
要想解决人工合成三尖杉酯碱的问题，还得从其生物合成的分子机制入手。海南粗榧就这样进入了乔飞团队的视线。
海南粗榧主要分布在海南岛，是我国特有的濒危植物。由于海南粗榧是国内含有抑瘤生物碱种类最多和含量最高的树种，其提炼药物对各类肿瘤、白血病和急性淋巴癌有特殊疗效，被确认为是最具潜力的天然抗癌药源和晚期癌症的最后一道防线，因此被誉为“抗癌奇木”。
中国林业科学研究院热带林业研究所研究员李意德曾撰文道，20世纪70年代，我国开展野生植物抗癌药物提取筛选研究，中国林科院热带林业研究所与中国人民解放军187医院等单位联合研究发现，海南粗榧中的三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱这两个成分具有良好的抑制癌细胞的作用，且产于海南的海南粗榧药效比云南产的效果好很多。这项研究成果于1985年获得了国家科学技术进步奖一等奖。
现已证明，海南粗榧树体内天然合成的酯类生物碱含有种类最多，共有11种，尤其是国内外报道对动物和临床有显著抑瘤作用的4种酯碱：三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、脱氧三尖杉酯碱和异三尖杉酯碱，在海南粗榧中含量最高，动物及临床试验效果也比其他树种显著，对各类白血病及急性淋巴癌有特殊疗效。
然而，海南粗榧生长缓慢、数量稀少、零星分布于海南岛热带雨林之中。乔飞告诉《中国科学报》，上世纪70年代，热科院植物园里种下了两棵海南粗榧，然而至今树干直径只有20厘米。
“全海南大约分布有几千株，已经被列为国家二级保护植物。而且，海南粗榧开花成熟需要200多年的生长期。”已在海南工作12年的乔飞印象中，只见过两株成年海南粗榧结果。海南粗榧雌雄异株，那些零星分布的雌树，往往由于周围缺乏雄树而无法受精结果。
如何大量获取该类抗癌药物并且不破坏野生植物资源？这成为乔飞团队想要解决的难题。
解析碳骨架合成通路
资料显示，三尖杉酯类生物碱属于苯乙基异喹啉类生物碱（PIAs），PIAs是一类重要的天然产物，主要有3种类型，包括秋水仙碱、三尖杉碱和高刺酮碱。该类化合物具有相同的碳骨架，但是该碳骨架的生物合成通路一直未能详细勾勒，在研究上尚属空白。
论文共同通讯作者、热科院热带作物品种资源研究所助理研究员孙化鹏介绍，为解决三尖杉酯类生物碱人工合成的难题，2011年开始，他们选择三尖杉科植物中生物碱含量最高的海南粗榧作为研究对象，希望解析其合成通路，并找到相关的关键基因。
然而，作为一种裸子植物，海南粗榧基因组庞大，估计约有20G大小，目前尚未获得可供参考的基因组图谱。而三尖杉生物酯碱的生物合成通路的解析，在世界上尚属空白，没有可以参考的资料。这些为解析合成通路、寻找关键基因带来了巨大的困难。
“三尖杉生物酯碱的生物合成已知分为上中下游三条主要通路。”乔飞介绍，第一步，上游通路合成碳骨架，这种骨架在PIAs中基本相同；第二步，中游通路对碳骨架进行变构，把碳骨架“扭”成不同结构，形成母核；第三步，下游通路给母核加上一个小分子组成的“小尾巴”，使得该结构获得活性，从而成为不同类型的三尖杉生物酯碱。
“我们从上游通路入手，对关键氨基酸进行搜寻、功能注释、进化分析等，并推测其可能属于病程相关蛋白家族。”乔飞解释道，病程相关蛋白原来是一类作用不明晰的蛋白质，往往在植物遭受到病害的条件下大量产生，故而得名。
借助全长转录组，他们对病程相关蛋白家族成员进行了逐个验证。经过长期反复实验研究，他们发现了PIAs碳骨架形成关键酶PSS。进而，他们又对PIAs母核上游生物合成中7步共30个候选基因进行了全部的功能验证，打通了整个合成通路。
结果发现，三尖杉酯类生物碱碳骨架由关键节点性化合物4-羟基苯丙醛（4-HDCA）和多巴胺缩合而成。
多巴胺自半个多世纪之前发现以来，人们已经逐步明确其在多数动植物中均由酪氨酸衍生而来。但在能合成生物碱的植物中，人们并没有找到合成多巴胺的同源基因。这使得生物碱植物中多巴胺的生物合成成为一个待解之谜。
孙化鹏介绍，他们经过多轮筛选验证实验，明确了多酚氧化酶PPO家族承担着在生物碱植物中催化合成多巴胺的作用。而4-羟基苯丙醛由肉桂酸羟基化形成。二者在病程相关蛋白（PR-10）催化之下，缩合形成了PIAs碳骨架，完成了上游通路。
从三角瓶到工业发酵罐
海南粗榧组培苗。受访者供图
“上游合成通路的解析将极大的帮助利用生物工程技术生产三尖杉酯类生物碱药物，不仅可以降低药物的价格，还可以减少从野外采集植物，从而保护野生植物。”乔飞说。
不过，中游和下游通路尚未解析，乔飞认为，这距离人工生物合成三尖杉酯类生物碱药物尚远。因此，他们准备效仿美国和韩国利用红豆杉细胞反应器生产紫杉醇的方法，研发利用海南粗榧细胞工程技术，创建适合液体悬浮培养的细胞系，诱导产生三尖杉酯类生物碱。据悉，这一工作已经在实验室阶段获得了较为成功的进展。
“接下来就是进一步研发如何提高产量。此外，从三角瓶的实验室研究放大到工业发酵罐，里面还有非常多的工艺需要研发。”乔飞告诉《中国科学报》，目前，类似的发酵工艺仅少数几个国家掌握，作为技术秘密没有资料可以参考，他们只能靠自己一步步攻克难关。
这项工作为获取该类生物碱提供了新的思路和方法，为保护和开发海南粗榧奠定了坚实基础。
“我国热带地区植物资源丰富，蕴含着丰富的基因资源。特别是药用植物方面，很多珍稀基因资源仍有待挖掘。待基因资源、代谢通路明确后，即可结合现代生物技术，通过基因工程、细胞工程等技术，实现药物现代化生产。”乔飞说。
相关论文信息：https://doi.org/10.1073/pnas.2209339120